رنگ‌آمیزی لاکتوفنل کاتن بلو برای قارچ‌ها 

محلول لاکتوفنول کاتن بلو  (LPCB) یک عامل رنگ‌آمیزی است که برای تهیه لام میکروسکوپی جهت بررسی قارچ‌ها استفاده می‌شود. با استفاده از این محلول عناصر قارچی زیر میکروسکوپ آبی رنگ دیده می‌شوند.

ممکن است در ذهن خود با این پرسش مواجه شوید که چرا باید این تکنیک رنگ‌آمیزی را یاد بگیریم و یا هدف این تکنیک چیست؟

پاسخ این سوال ساده است. قارچ‌ها نوعی ارگانیسم یوکاریوتی هستند و به دو گروه عمده مخمر (yeast) و کپک (molds) تقسیم می‌شوند که اغلب دارای دیواره سلولی کیتین هستند. سلول‌های قارچی می‌توانند برای انسان مفید و یا مضر باشند. بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌ها از قارچ‌ها تولید شده و همچنین در فرآیند تخمیر صنعتی نیز مورد استفاده قرار می‌گیرند. از طرف دیگر برخی گونه‌ها ممکن است بیماری‌زایی داشته و مواد سمی تولید کنند. از همین رو بررسی گونه‌های قارچی بسیار مهم است زیرا به این وسیله می‌توان قارچ‌ها را کنترل کرد یا داروهایی برای عفونت قارچی تولید نمود. از آنجایی که این ارگانیسم‌ها ساختار میکروسکوپی دارند، نمی‌توانیم آن‌ها را با چشم غیر مسلح ببینیم. به کمک رنگ‌آمیزی مناسب می‌توان این ارگانیسم‌ها را مشاهده و ساختار آن‌ها را بررسی نمود.

در این مطلب قصد داریم تا شما را با تکنیک لاکتوفنل کاتن بلو و مراحل انجام آن آشنا کنیم. پس با ما همراه باشید.

رنگ‌آمیزی لاکتوفنل کاتن بلو برای قارچ‌ها

همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، بررسی گونه‌های قارچی از جنبه‌های مختلفی حائز اهمیت است. اما پیش از بررسی سلول‌های قارچی زیر میکروسکوپ، باید آن‌ها را رنگ‌آمیزی نمود.

رنگ‌آمیزی سلول‌های قارچی را می‌توان با لاکتوفنول کاتن بلو انجام داد. ریزوپوس، آسپرژیلوس، پنی‌سیلیوم، فوزاریوم، کاندیدا و موکور نمونه قارچ‌هایی هستند که می‌توان آن‌ها را به کمک تکنیک لاکتوفنل کاتن بلو شناسایی کرد. تکنیک رنگ‌آمیزی لاکتوفنل کاتن بلو با نام تکنیک مانتینگ قارچ (mounting of fungus) نیز شناخته می‌شود. لاکتوفنل کاتن بلو شامل اجزای زیر است که هریک کاربرد مخصوص خود را دارند:

• فنل:  برای کشتن قارچ‌ها استفاده می‌شود.
• اسید لاکتیک: به عنوان یک عامل شفاف کننده عمل کرده و به حفظ ساختار قارچ کمک می‌کند.
• کاتن بلو: یک رنگ آنیلین است که دیواره‌ سلولی کیتینی قارچ را رنگ‌آمیزی کرده و در نتیجه سبب ایجاد تمایز می‌شود.
• گلیسرول: یک ماده چسبناک است که از خشک شدن نمونه روی لام آماده شده جلوگیری می‌کند.

آماده‌سازی محلول لاکتوفنل کاتن بلو

ترکیبات لازم برای تهیه یک لیتر محلول لاکتوفنل کاتن بلو در جدول ۱ ذکر شده است.

جدول ۱. ترکیبات لازم برای تهیه یک لیتر محلول لاکتوفنل کاتن بلو

آماده سازی محلول لاکتوفنول کاتن بلو معمولا طی دو روز انجام می‌شود. این فرایند شامل پنج مرحله مهم زیر است:

1.     انحلال کاتن بلو: در روز اول، کاتن بلو را با آب مقطر مخلوط کرده و اجازه دهید یک شب در دمای اتاق بماند.

2.     انحلال کریستال‌های فنل:  روز دوم، بلورهای فنل را به کمک هات پلیت در اسید لاکتیک حل کنید تا فنل حل شود. در این مرحله دستورالعمل‌‎های ایمنی مناسب را برای حل شدن کریستال فنل در اسید لاکتیک رعایت کنید.

3.     افزودن گلیسرول: گلیسرول را به مخلوط فنل و اسید لاکتیک اضافه کنید و مطمئن شوید که کاملا حل شده است.

4.     فیلتراسیون: محلول کاتن بلو و آب مقطر را به ترکیب فنل، گلیسرول و اسید لاکتیک اضافه کرده و محلول نهایی را فیلتر کنید.

5.     ذخیره‌سازی:  پس از آماده‌سازی محلول نهایی، آن را در دمای اتاق نگهداری کنید. توجه داشته باشید که دور از نور مستقیم قرار گیرد. در این شرایط، ماندگاری آن از تاریخ آماده‌سازی، ۵۲ هفته خواهد بود.

روش رنگ آمیزی لاکتوفنل کاتن بلو

رنگ‌آمیزی لاکتوفنول کاتن بلو را می‌توان به دو روش انجام داد. روش اول با نام Tease Mount شناخته می‌شود و در آن قسمتی از کشت با سوزن برداشته شده و روی لام قرار داده می‌شود، یک قطره لاکتوفنل کاتن بلو (LPCB) به آن اضافه شده، لامل روی آن قرار گرفته و در نهایت لام زیر میکروسکوپ بررسی خواهد شد. در روش دوم که روش چسب اسکاچ (Scotch Tape Method)  نامیده می‌شود، از یک نوار چسب استفاده می‌گردد. در ادامه به بررسی چگونگی انجام هر یک از این دو روش خواهیم پرداخت.

روش Tease Mount

1.     یک قطره لاکتوفنول بلو را روی لام میکروسکوپ تمیز بریزید.

2.     لوپ را در بالاترین قسمت شعله‌ی چراغ بونزن نگه دارید (قسمت آبی رنگ شعله) تا کاملا داغ شده و رنگ آن قرمز شود. اطمینان حاصل کنید که لوپ قبل از اینکه در کشت قارچی بگیرد، کاملا سرد شده باشد. (معمولا پس از گذشت ده ثانیه به اندازه کافی سرد می‌شود).

3.     لوله حاوی کشت را برداشته و درب آن را باز کنید. درب لوله را به هیچ عنوان روی میز کار قرار ندهید. دهانه لوله را حرارت دهید.

4.     مقدار کمی از کشت را به کمک لوپ بردارید.

5.     مجددا دهانه لوله را حرارت دهید و درب آن را ببندید.

6.     نمونه قارچی را به قطره لاکتوفنول بلو اضافه کنید.

7.     به کمک سوزن‌های dissecting استریل، قارچ را به آرامی از هم جدا کنید تا به صورت یک لایه نازک در لاکتوفنول بلو پخش شود. این کار باعث می‌شود تا هوای محبوس شده بین هیف‌ها خارج شود.

8.     یک لامل تمیز را روی مخلوط لاکتوفنول بلو و نمونه قارچی قرار دهید. سعی کنید حین قرار دادن لامل روی لام حباب هوا ایجاد نشود.

9.     پس از فیکس کردن لامل روی لام، می‌توانید نمونه قارچی را زیر میکروسکوپ بررسی کنید.

روش چسب اسکاچ

1.     یک نوار چسب شفاف را بریده و دو انتهای آن را بین انگشت شست و انگشت اشاره خود بگذارید. نوار چسب را به شکل یک حلقه در بیاورید به طوری که قسمت چسبنده آن به سمت بیرون باشد.

2.     درب پلیت حاوی محیط کشت را باز کرده و نوار چسب را روی کلنی‌های قارچی فشار دهید.

3.     یک قطره لاکتوفنول بلو را روی یک لام شیشه‌ای تمیز بریزید.

4.     نوار چسب آغشته به نمونه را روی لاکتوفنول کاتن بلو فشار دهید و نوار را روی لام بچسبانید.

5.     یک قطره دیگر لاکتوفنول بلو روی نوار چسب بریزید.

6.     لامل را روی لام قرار داده و لام را زیر میکروسکوپ بررسی کنید.

نتیجه تکنیک رنگ آمیزی لاکتوفنول کاتن بلو

حین بررسی میکروسکوپی لام رنگ آمیزی شده با استفاده از تکنیک لاکتوفنل کاتن بلو، اسپورهای قارچی، هیف‌ها و اجسام بارده به رنگ آبی تیره و زمینه آن‌ها آبی روشن خواهد بود.

توجه: بررسی اولیه میکروسکوپی را با استفاده از یک لنز با بزرگنمایی کمتر انجام دهید. قسمت‌های نازک‌تر که عموماً در لبه لامل قرار دارند. تصاویر بهتری را ارائه می‌دهند. برای بررسی دقیق‌تر اسپورها و سایر ساختارها از لنزهایی با بزرگنمایی بیشتر استفاده کنید.

محدودیت‌های رنگ‌آمیزی به روش لاکتوفنل کاتن بلو

همانطور که در قسمت‌‌های قبلی نیز گفته شد، استفاده از تکنیک لاکتوفنل کاتن بلو به رنگ‌آمیزی و شناسایی قارچ‌ها کمک زیادی می‌کند. با این وجود نمی‌توان گفت که یک روش همیشه و در هر شرایطی موثر است. تکنیک رنگ‌آمیزی لاکتوفنل کاتن بلو نیز دارای محدودیت‌هایی است که در ادامه به اشاره‌ای کوتاه به آن‌ها خواهیم داشت.

• لام رنگ‌آمیزی شده با لاکتوفنول کاتن بلو را نمی‌توان برای مدت زمان طولانی ذخیره کرد. به ویژه در روش چسب اسکاچ. زیرا پایه چسب اسکاچ موقت است و در نهایت حل می‌شود.

• رنگ‌آمیزی به روش لاکتوفنل کاتن بلو برای مشاهده تمایز اولیه سلول قارچی مناسب نیست.
• این تکنیک در برخی موارد ممکن است باعث اختلال در مورفولوژی قارچ شود.

جمع‌بندی

همانطور که گفته شد تکنیک رنگ‌آمیزی لاکتوفنل کاتن بلو یک روش مهم و پرکاربرد برای رنگ‌آمیزی قارچ‌ها و بررسی میکروسکوپی آن‌ها است. در این مطلب سعی کردیم در رابطه با مراحل انجام این تکنیک، ترکیبات مورد استفاده در آن و نتایج و محدودیت‌های این روش اطلاعاتی ارائه کنیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد. 

برگرفته از مجله پل ایده‌آل پارس