EDTA - ضد انعقاد خون

موارد استفاده EDTA به عنوان ماده ضد انعقاد                      
مقدمه
نمك‌هاي Ethylenediaminetetra-acetic.Acid(EDTA) به علت حفظ سلول‌هاي خوني به عنوان ماده ضد انعقاد مناسب در آزمايشگاه‌هاي هماتولوژي بكار مي‌رود. اين ماده توانايي پيوند با تعدادي از عناصر را داشته و با اتصال به كلسيم مي‌تواند آن‌را از محيط خارج نمايد. كلسيم و ديگر يون‌هاي دو ظرفيتي مي‌توانند به عنوان كوفاكتورهاي آنزيم عمل نمايند و به همين دليل نمك‌هاي EDTA جهت تعيين مقدار كلسيم، آهن، آلكالن فسفاتاز، كراتين كيناز و لوسين آمينو پپتيد از مناسب نيستند.
موارد استفاده
EDTA جهت آزمايشات زير در هماتولوژي توصيه مي‌گردد.
1 – هماتوكريت (روش ميكروهماكريت) – شمارش پلاكت – شمارش گلبول‌هاي سرخ و سفيد انداز‌ه‌گيري هموگلوبين – گسترش خون محيطي جهت افتراق سلولي – شمارش رتيكولوسيت – فلوسيتومتري – سديمانتاسيون (پس از تصحيح باسيترات سديم). نمونه خون تهيه شده با ضد انعقاد EDTA در مدت 6 ساعت در حرارت آزمايشگاه بايد از آزمايش گردد. استفاده از EDTA در ساير موارد مثل اندازه گيري سيكلوسپورين (Cyclosporin) و عناصر بسيار كمياب توصيه شده است. لازم به ذكر است كه نمك‌هاي EDTA مي‌توانند با ظروف فلزي يا درب آنها واكنش نشان داده و يون‌هاي فلزي را آزاد كنند بنابراين براي استفاده از EDTA بايد از ظروف مناسبي استفاده شود.

انواع EDTA
EDTA به صورت اسيد آزاد به تنهایی به عنوان ضد انعقاد مصرف نمي‌گردد. بيشتر نمك‌هاي آن مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اسيد آزاد آن داراي وزن ملكولي 2/292 و به صورت پودر سفيد بدون بو مي باشد. محلول اشباع آن (در 20 درجه سانتيگراد) 2000 تا 300 ميلي گرم در ليتر است.
EDTA دي سديك به همراه دو ملكول آب (EDTA-NA2, 2H2O) داراي وزن ملكولي 2/372 و به صورت پودر كريستال بدون بو مي‌باشد. حلاليت آن در حرارت 20 درجه سانتي‌گراد است.
EDTA دي پتاسيك به همراه دو ملكول آب (EDTA-K2, 2H2O) داراي وزن ملكولي 4/404 مي‌باشد. اين نوع بيشتر در اروپا و ژاپن استفاده مي‌شود و به تازگي در آمريكا مورد توجه قرار گرفته است. اين نمك نسبت به نمك‌هاي دي سديك از حلاليت بيشتري برخوردار است.
EDTA تري پتاسيك (EDTA-K3) داراي وزن ملكولي 406 و به صورت مايعي شفاف، بدون بو مي‌باشد، نوع خشك شده آن به صورت پودر سفيد بدون بو است.

PH نمك‌ها
PH نمك‌هاي تري پتاسيك نزديك به PH خون (8-7) مي‌باشد، اين مقدار بالاتر از PH نمك‌هاي دي سديك (3/5–5/4) است، در تست‌هاي خاصي كه بستگي به شرايط اسيدي يا قليائي دارند مي‌توان با توجه به PH مورد لزوم EDTA مناسب را بكار برد. در PH كمتر از چهار، كمپلكس متصل به كلسيم پايدار نبوده و ممكن است تجزيه و جدا گردد.

خواص ضد انعقاد
بطور كلي EDTA به عنوان يك ماده ضد انعقاد در تست‌هاي انعقادي بكار نمي‌رود مگر هنگامي‌كه بررسي و آزمايش پلاكت مورد نظر باشد. بايد توجه نمود كه در بعضي بيماران بعلت وجود آنتي باديهاي پلاكتي، با وجود EDTA پلاكت‌ها به صورت چسبيده به يكديگر مشاهده مي‌شوند، لذا در اين موارد نبايد EDTA مصرف گردد. در ضمن قابل ذكر است كه فاكتور V در مقابل EDTA ناپايدار است.

مقادير لازم
ميزان مصرف EDTA-K3 ، 2/1 ميلي‌گرم براي هر ميلي ليتر خون است ولي EDTA دي پتاسيك و دي سديك همراه با دو ملكول آب 25/0 ± 5/1 ميلي‌گرم براي هر ميلي‌ليتر خون مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

پايداري نمونه
در حرارت آزمايشگاه بيشتر از 6 ساعت از زمان خون گرفتن در لوله حاوي EDTA نبايد بگذرد ولي در حرارت 4 درجه سانتي‌گراد (يخچال) تا 24 ساعت P.C.V, Hb, W.B.C, R.B.C, MCV, Platelet پايدار است.
مقدار EDTA مصرفي بايد متناسب با مقدار خون باشد و اگر EDTA بيشتر از اندازه مصرف گردد گلبول‌هاي سرخ و سفيد چروكيده و منهدم مي‌گردند كه اين به علت افزايش غلظت يوني مي‌باشد. افزايش EDTA بيش از 2 ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر سبب كاهش قابل توجهي در P.C.V و در نتيجه افزايش MCHC مي‌شود و نيز همين افزايش بر روي پلاكت‌ها اثر گذاشته و سبب تورم و پاشيدگي آن‌ها مي‌شود، شمارش مجدد اين ذرات پلاكني سبب افزايش غير واقعي تعداد پلاكت‌ها مي‌گردد. كاهش ميزان EDTA باعث ايجاد لخته‌هاي ريز گرديده كه تاثير قابل توجهي در اندازه‌گيري پلاكت‌ها مي‌گذارند.

تاثير ماده ضد انعقاد روي انگل مالاريا
بهترين روش براي تشخيص انگل مالاريا استفاده از گسترش بدون ماده ضد انعقاد است كه بطور مستقيم از خون مويرگي و يا وريدي تهيه شده باشد. ولي چون برخي از نمونه‌ها از ساير مراكز ارسال مي‌گردد و يا انگل بطور اتفاقي همراه با ماده ضد انعقاد دريافت مي‌شود لازم است كه از اثرات ماده ضد انعقاد بر روي مالاريا اطلاع داشت.
كليه مواد ضد انعقاد سبب تغييراتي در انگل‌هاي مالاريا گرديده كه با توجه به چرخه زندگي انگل، فاصله طي شده تا انجام آزمايش و نوع ماده ضد انعقاد مورد مصرف متفاوت مي‌باشد.
چنانچه استفاده از ماده ضد انعقاد الزامي است بهتر است هر چه سريع‌تر گسترش را تهيه نمود.
ماده ضد انعقاد انتخابي EDTA دي پتاسيك است، اين ماده براي مدت كوتاهي تغييراتي در روي انگل بوجود نمي‌آورد ولي اگر بيش از 6 ساعت در مجاورت خون باشد سبب اختلالات زير مي‌گردد.
1 - مرحله تكامل جنسي سير خود را ادامه خواهد داد و ميكروگامتوسيت پس از بلوغ گامتوسيت را داخل خون آزاد مي‌كند. اين گامتها در تشخيص افتراقي با بورليا قرار مي‌گيرند.
گامتوسيت‌هاي هلالي شكل پلاسموديوم فالسيپارم بدور خود جمع شده شبيه پلاسموديوم مالاريا مي‌شوند.
2 – تروفوئيت بالغ پلاسموديوم ويواكس در اثر تماس طولاني با EDTA بهم فشرده شده و اگر اين زمان بيش از اندازه طولاني باشد گلبول‌هاي سرخ حاوي گامتوسيت و شيزونت بالغ همراه انگل نابود مي‌شوند ولي رنگدانه هموزين مالاريا هميشه پايدار است و مي‌تواند براي يك فرد با تجربه كمكي در جهت يافتن و حتي تشخيص نوع انگل باشد.
3 – نماي گلبول سرخ با دندانه‌دار شدن و روي هم قرار گرفتن ديواره سلولي تغيير مي‌كنند.
4 – گلبول‌هاي سرخ منقوط (مبتلا به پلاسموديوم ويواكس) قابل رويت نخواهد بود.
هر گاه نمونه برداري در اتر EDTA تغييرات قابل توجهي نشان دهد بهتر است نمونه‌گيري را تكرار نموده و در اين صورت گسترش را به صورت مستقيم و بدون استفاده از ماده ضد انعقاد تهيه نمود.

تشخيص EDTA
روش‌هاي متفاوتي جهت تشخيص انواع EDTA وجود دارد كه ساده‌ترين آن عبارتست از :
دو قطره از محلول تيوسيانات آلومينيوم (8 گرم درصد ميلي ليتر آب مقطر) و دو قطره از محلول كلرورفريك (9 گرم درصد ميلي ليتر آب مقطر) را به 5 ميلي‌ليتر آب مقطر بدون يون در لوله آزمايش اضافه مي‌كنيم محلول قرمز رنگي حاصل مي‌شود. تقريباً در حدود 50 ميلي‌گرم نمك مورد نظر را به محلول فوق اضافه كرده در صورت وجود EDTA ، رنگ قرمز تبديل به زرد خواهد شد.