موارد استفاده EDTA بعنوان ماده ضدانعقاد

مقدمه
نمكهاي Ethylenediaminetetra-acetic.Acid (EDTA) به علت حفظ سلولهاي خوني بعنوان ماده ضد انعقاد مناسب در آزمايشگاههاي هماتولوژي بكار مي رود. اين ماده توانايي پيوند با تعدادي از عناصر را داشته و با اتصال به كلسيم مي تواند آنرا از محيط خارج نمايد. كلسيم و ديگر يونهاي دوظرفيتي مي توانند بعنوان كوفاكتورهاي آنزيم عمل نمايند و بهمين دليل نمكهاي EDTA جهت تعيين مقدار كلسيم، آهن، آلكالن فسفاتاز، كراتين كيناز و لوسين آمينو پپتيد از مناسب نيستند.
موارد استفاده
EDTA جهت آزمايشات زير در هماتولوژي توصيه مي گردد.
1 – هماتوكريت (روش ميكروهماكريت) – شمارش پلاكت – شمارش گلبولهاي سرخ و سفيد اندازه گيري هموگلوبين – گسترش خون محيطي جهت افتراق سلولي – شمارش رتيكولوسيت – فلوسيتومتري – سديمانتاسيون (پس از تصحيح باسيترات سديم). نمونه خون تهيه شده با ضد انعقاد EDTA در مدت 6 ساعت در حرارت آزمايشگاه بايد از آزمايش گردد. استفاده از EDTA در ساير موارد مثل اندازه گيري سيكلوسپورين (Cyclosporin) و عناصر بسيار كمياب توصيه شده است. لازم به ذكر است كه نمكهاي EDTA مي توانند با ظروف فلزي يا درب آنها واكنش نشان داده و يونهاي فلزي را آزاد كنند بنابراين براي استفاده از EDTA بايد از ظروف مناسبي استفاده شود.

انواع EDTA
EDTA به صورت اسيد آزاد به تنهائي بعنوان ضد انعقاد مصرف نمي گردد. بيشتر نمكهاي آن مورد استفاده قرار مي گيرد. اسيد آزاد آن داراي وزن ملكولي 2/292 و به صورت پودر سفيد بدون بو مي باشد. محلول اشباع آن (در 20 درجه سانتيگراد) 2000 تا 300 ميلي گرم در ليتر است.
EDTA دي سديك به همراه دو ملكول آب (EDTA-NA2, 2H2O) داراي وزن ملكولي 2/372 و به صورت پودر كريستال بدون بو مي باشد. حلاليت آن در حرارت 20 درجه سانتيگراد است.
EDTA دي پتاسيك به همراه دو ملكول آب (EDTA-K2, 2H2O) داراي وزن ملكولي 4/404 مي باشد. اين نوع بيشتر در اروپاو ژاپن استفاده مي شود و به تازگي در آمريكا مورد توجه قرار گرفته است. اين نمك نسبت به نمكهاي دي سديك از حلاليت بيشتري برخوردار است.
EDTA تري پتاسيك (EDTA-K3) داراي وزن ملكولي 406 و بصورت مايعي شفاف، بدون بو مي باشد، نوع خشك شده آن به صورت پودر سفيد بدون بو است.

PH نمكها
PH نمكهاي تري پتاسيك نزديك به PH خون (8-7) مي باشد، اين مقدار بالاتر از PH نمكهاي دي سديك (3/5–5/4) است، در تستهاي خاصي كه بستگي به شرايط اسيدي يا قليائي دارند مي توان با توجه به PH مورد لزوم EDTA مناسب را بكار برد. در PH كمتر از چهار، كمپلكس متصل به كلسيم پايدار نبوده و ممكن است تجزيه و جدا گردد.

خواص ضد انعقاد
بطور كلي EDTA بعنوان يك ماده ضد انعقاد در تستهاي انعقادي بكار نمي رود مگر هنگاميكه بررسي و آزمايش پلاكت مورد نظر باشد. بايد توجه نمود كه در بعضي بيماران بعلت وجود آنتي باديهاي پلاكتي، با وجود EDTA پلاكتها به صورت چسبيده به يكديگر مشاهده مي شوند، لذا در اين موارد نبايد EDTA مصرف گردد. در ضمن قابل ذكر است كه فاكتور V در مقابل EDTA ناپايدار است.

مقادير لازم
ميزان مصرف EDTA-K3 ، 2/1 ميلي گرم براي هر ميلي ليتر خون است ولي EDTA دي پتاسيك و دي سديك همراه با دو ملكول آب 25/0 ± 5/1 ميلي گرم براي هر ميلي ليتر خون مورد استفاده قرار مي گيرد.

پايداري نمونه
در حرارت آزمايشگاه بيشتر از 6 ساعت از زمان گرفتن خون در لوله حاوي EDTA نبايد بگذرد ولي در حرارت 4 درجه سانتيگراد (يخچال) تا 24 ساعت P.C.V, Hb, W.B.C, R.B.C, MCV, Platelet پايدار است.
مقدار EDTA مصرفي بايد متناسب با مقدار خون باشد و اگر EDTA بيشتر از اندازه مصرف گردد گلبولهاي سرخ و سفيد چروكيده و منهدم مي گردند كه اين به علت افزايش غلظت يوني مي باشد. افزايش EDTA بيش از 2 ميلي گرم در ميلي ليتر سبب كاهش قابل توجهي در P.C.V و در نتيجه افزايش MCHC مي شود و نيز همين افزايش بر روي پلاكتها اثر گذاشته و سبب تورم و پاشيدگي آنها مي شود، شمارش مجدد اين ذرات پلاكني سبب افزايش غيرواقعي تعداد پلاكتها مي گردد. كاهش ميزان EDTA باعث ايجاد لخته هاي ريز گرديده كه تاثير قابل توجهي در اندازه گيري پلاكتها مي گذارند.

تاثير ماده ضد انعقاد روي انگل مالاريا
بهترين روش براي تشخيص انگل مالاريا استفاده از گسترش بدون ماده ضد انعقاد است كه بطور مستقيم از خون مويرگي و يا وريدي تهيه شده باشد. ولي چون برخي از نمونه ها از ساير مراكز ارسال مي گردد و يا انگل بطور اتفاقي همراه با ماده ضد انعقاد دريافت مي شود لازم است كه از اثرات ماده ضد انعقاد بر روي مالاريا اطلاع داشت.
كليه مواد ضد انعقاد سبب تغييراتي در انگلهاي مالاريا گرديده كه با توجه به چرخه زندگي انگل، فاصله طي شده تا انجام آزمايش و نوع ماده ضد انعقاد مورد مصرف متفاوت مي باشد.
چنانچه استفاده از ماده ضد انعقاد الزامي است بهتر است هر چه سريعتر گسترش را تهيه نمود.
ماده ضد انعقاد انتخابي EDTA دي پتاسيك است، اين ماده براي مدت كوتاهي تغييراتي در روي انگل بوجود نمي آورد ولي اگر بيش از 6 ساعت در مجاورت خون باشد سبب اختلالات زير مي گردد.
1 - مرحله تكامل جنسي سير خود را ادامه خواهد داد و ميكروگامتوسيت پس از بلوغ گامتوسيت را داخل خون آزاد مي كند. اين گامتها در تشخيص افتراقي با بورليا قرار مي گيرند.
گامتوسيتهاي هلالي شكل پلاسموديوم فالسيپارم بدور خود جمع شده شبيه پلاسموديوم مالاريا مي شوند.
2 – تروفوئيت بالغ پلاسموديوم ويواكس در اثر تماس طولاني با EDTA بهم فشرده شده و اگر اين زمان بيش از اندازه طولاني باشد گلبولهاي سرخ حاوي گامتوسيت و شيزونت بالغ همراه انگل نابود ميشوند ولي رنگدانه هموزين مالاريا هميشه پايدار است و مي تواند براي يك فرد با تجربه كمكي در جهت يافتن و حتي تشخيص نوع انگل باشد.
3 – نماي گلبول سرخ با دندانه دار شدن و رويهم قرار گرفتن ديواره سلولي تغيير مي كنند.
4 – گلبولهاي سرخ منقوط (مبتلا به پلاسموديوم ويواكس) قابل رويت نخواهد بود.
هر گاه نمونه برداري در اتر EDTA تغييرات قابل توجهي نشان دهد بهتر است نمونه گيري را تكرار نموده و در اين صورت گسترش را به صورت مستقيم و بدون استفاده از ماده ضد انعقاد تهيه نمود.

تشخيص EDTA
روشهاي متفاوتي جهت تشخيص انواع EDTA وجود دارد كه ساده ترين آن عبارتست از :
دو قطره از محلول تيوسيانات آلومينيوم (8 گرم درصد ميلي ليتر آب مقطر) و دو قطره از محلول كلرور فريك (9 گرم درصد ميلي ليتر آب مقطر) را به 5 ميلي ليتر آب مقطر بدون يون در لوله آزمايش اضافه مي كنيم محلول قرمز رنگي حاصل مي شود. تقريباً در حدود 50 ميلي گرم نمك مورد نظر را به محلول فوق اضافه كرده در صورت وجود EDTA ، رنگ قرمز تبديل به زرد خواهد شد.